Septiembre 2020 | 41-3

Cromatografía, una herramienta esencial de laboratorio

La cromatografía es una de los principales métodos analíticos y permite la separación y cuantificación de sustancias muy similar en estructura y propiedades químicas.

Norma I. Kamiya*

*Sección Química, EEAOC, normakamiya@eeaoc.org.ar

La cromatografía es una técnica con fines separativos que se emplea cuando se requiere separar los componentes de una mezcla compleja de compuestos. Puede ser utilizada en forma preparativa para purificar o aislar componentes de una mezcla, o con fines analíticos cualitativos y cuantitativos, es decir, para definir composición de la mezcla y cantidad de cada uno o alguno de dichos componentes.

Si bien los estudios relacionados a los fenómenos asociados a la cromatografía se remontan a mediados del siglo XIX, no es sino hasta inicios del siglo XX que se atribuye el uso de este término al botánico ruso Mikhail Tswett. La aplicación de este nombre -que deriva de los vocablos griegos chroma y graphein que significan color y escribir, respectivamente- se debió a la visualización de la separación de componentes de extractos vegetales en bandas de colores, al pasar por una columna de carbonato de calcio.

A quienes les interese conocer más sobre la historia de esta técnica les resultará interesante consultar la línea de tiempo construida por Julissa Jasso en Science and Technologies (Jasso, 2020).

La cromatografía agrupa a un conjunto de métodos que, en general, se basan en la retención diferenciada de los compuestos cuando son sometidos a dos fases inmiscibles, una inmovilizada, llamada fase estacionaria; y la otra que fluye a través de la primera y que es denominada fase móvil (Skoog, 2008).

Hay diversas formas de clasificar los distintos tipos de cromatografías, una de ellas es tomando en cuenta las características de las fases estacionaria y móvil. (Tabla 1)

 

En la actualidad se emplean métodos cromatográficos instrumentales, los conocidos cromatógrafos gaseosos, líquidos y de fluidos supercríticos. En estos casos, para poner de manifiesto la separación obtenida se emplean diversos detectores que realizan un gráfico llamado cromatograma, de intensidad de señal en función del tiempo (Figura 1).

 

La cromatografía por sí misma no es una técnica que permita identificar los compuestos que se separan; para lograr este objetivo se realizan comparaciones contra estándares, excepto en el caso de acoplamiento, con técnicas de espectrometría de masas.

Hasta hace unos años pocos eran los productores del área alimentos que sabían de esta técnica; sin embargo, se ha tornado popular debido a sus innumerables aplicaciones, entre las que se pueden citar análisis de aromas, como por ejemplo componentes de aceites esenciales, aminoácidos, ácidos orgánicos livianos, aminas, ácidos grasos, antocianinas, alcoholes, aniones y cationes, carbohidratos, colorantes, conservantes, cumarinas, edulcorantes, fenoles, flavonoides, hidrocarburos, muestras ambientales, plaguicidas, vitaminas y proteínas.

En líneas generales, los compuestos volátiles no termolábiles se analizan por cromatografía gaseosa (Figura 2) y los poco volátiles y termolábiles, por cromatografía líquida. La cromatografía de fluido supercrítico es un híbrido entre cromatografía gaseosa y líquida y emplea como fase móvil gases en su punto crítico, que le confieren densidades, viscosidades y otras propiedades intermedias entre las características de esa sustancia en estado gaseoso y en estado líquido (Skoog, 2008).

Figura 2

Como cualquier equipo electrónico, es fundamental contar con una línea eléctrica estabilizada y un ambiente climatizado. Además, los cromatógrafos gaseosos requieren de la provisión de gases de alta pureza a través de una red con manómetros y reguladores para su control.

Los detectores más empleados en cromatografía gaseosa y algunas aplicaciones son:

  • Detector de Ionización a la llama (FID: Flame Ionization Detector): se emplea para determinaciones de componentes de esencias, alcoholes, ácidos grasos a través de sus ésteres metílicos (FAME, de sus siglas en inglés Fatty Acid Methyl Ester)
  • Detector de captura de electrones (ECD: Electron Capture Detector): especialmente usado por su gran sensibilidad para la detección de compuestos halogenados
  • Detector de Nitrógeno-Fósforo (NPD: Nitrogen-Phosphorous Detector): selectivo para compuestos nitrogenados y fosforados como algunos plaguicidas
  • Detector Fotométrico de Llama (FPD: Flame Photometric Detector): selectivo para compuestos con azufre y fósforos por ejemplo ciertos plaguicidas

Los detectores más empleados en cromatografía líquida y algunas aplicaciones son:

  • Detector de Índice de Refracción (RID: Refractive Index Detector): es un detector general basado en la diferencia de índice de refracción del compuesto respecto de la fase móvil. Posee innumerables usos, como por ejemplo análisis de hidratos de carbono, alcohol, ácidos orgánicos volátiles y conservantes
  • Detector Ultravioleta-Visible y de Arreglo de Diodos (UV-Vis: Ultraviolet-Visible; DAD: Diode Array Detector): el primero de estos detectores es de longitud de onda fija, es decir, se selecciona el valor al que se realizará la detección durante toda la corrida cromatográfica; y el segundo permite además detectar todas las longitudes de onda en un rango UV-Visible establecido, de forma tal que cada punto del cromatograma cuenta con la información de un espectro. Son unos de los detectores más empleados debido a su gran sensibilidad, por ejemplo para determinaciones de colorantes, saborizantes, flavonoides, cumarinas, antocianinas, vitaminas y aminoácidos
  • Detector de conductividad: se emplea luego de la separación por cromatografía iónica para la determinación de aniones y cationes, por ejemplo en aguas o en alcohol

Una mención especial se debe dar a los detectores basados en Espectrometría de Masas, considerada una de las técnicas más potentes y de múltiples aplicaciones para la identificación de compuestos. La cromatografía acoplada a la espectrometría de masas conjuga las técnicas más destacadas en la actualidad para la separación, identificación y confirmación de componentes de mezclas complejas. Si bien es amplia la variedad de técnicas basadas en espectrometría de masas, se pueden citar:

  • Detector de Masas Simple Cuadrupolo (MS o MSD: Mass Spectometry o Mass Selective Detector)
  • Detector de Tiempo de Vuelo (TOF: Time of Flight)
  • Detectores de Masas en tándem: Triple Cuadrupolo (QqQ), Trampa de Iones (IT: Ion Trap), Cuadrupolo-Trampa de Iones (QTrap), Cuadrupolo – Tiempo de Vuelo (QTOF: Quadrupole Time of Flight)

Los detectores de masas simple cuadrupolo se pueden emplear en modo de barrido de masas (Modos SCAN) o bien en modo selectivo (SIM: Selective Ion Monitoring).

Los detectores de masas tipo QqQ e IT presentan mayor sensibilidad y se emplean en la detección enfocada a identificar y cuantificar compuestos específicos. Los detectores QTrap permiten aumentar la confiabilidad en la identificación de compuestos.

Los detectores QTOF se emplean para la detección no enfocada y debido a que es un equipo de alta resolución de masas, permite la identificación por peso molecular.

Las aplicaciones de los detectores de masas son múltiples; los QqQ se emplean en laboratorios de rutina para determinaciones de residuos de plaguicidas debido a su gran robustez.

Los QTOF se aplican a estudios de biomoléculas como proteínas.

La Sección Química de la EEAOC cuenta con los siguientes cromatógrafos:

Gaseosos:

  • 1 PerkinElmer Clarus 680 con detector FID
  • 1 Agilent Technologies 6890 con detectores FID y micro-ECD
  • 1 Agilent Technologies 6890 con detector NPD
  • 1 Agilent Technologies 6850 con detector de masas simple cuadrupolo 5973
  • 1 Agilent Technologies 7890A con detector con detector tipo QqQ 7000
  • 1 Agilent Technologies 7890B con detector con detector tipo QqQ 7000D (Figura 3)

 

Figura 3

 

Líquidos:

  • 1 HPLC Waters Alliance con detectores RID, DAD, de conductividad con supresor de iones y electroquímico (Figura 4)
  • 1 UPLC Waters Acquity con detector UV (Figura 5)
  • 1 Shimadzu, Nexera con detector QqQ AB SCIEX triple cuadrupolo 5500 (Figura 6)
  • 1 Shimadzu, Nexera con detector QTrap AB SCIEX 4500
  • 1 UPLC Waters Acquity “H-Class” con detector QqQ Xevo TQ-S Micro

Este equipamiento permite cubrir los siguientes tipos de análisis, tanto para estudios internos dentro de Planes de Investigación como para brindar servicios a clientes externos:

  • Componentes volátiles de alcohol buen gusto y anhidro
  • Aniones cloruro y sulfato en alcohol anhidro
  • Perfil cromatográfico de aceites esenciales de frutas cítricas
  • Carbohidratos
  • Ácidos orgánicos volátiles
  • 2,3-butanodiol
  • Residuos de plaguicidas
  • Ftalatos
  • BHT

 

Cabe destacar que los laboratorios de la Sección Química cuentan con certificación ISO 9001:2015 y poseen acreditación de ensayos bajo ISO 17025:2017 para las determinaciones de residuos de plaguicidas.

Es importante remarcar la fortaleza de contar con profesionales altamente capacitados y dedicados a seguir los lineamientos de la Política de Calidad de la Sección respecto al desarrollo de nuevas metodologías aplicadas a análisis requeridos por el medio productivo, como así también a brindar capacitación y asesoramiento en esta temática.

Bibliografía citada

Jasso, J. Historia de la cromatografía. Science and Technologies [En línea]. Disponible en https://www.timetoast.com/timelines/historia-de-la-cromatografia (consultado 20 de setiembre 2020)
Skoog, D. A.; F. J. Holler y S. R. Crouch. 2008. Principios de Análisis Instrumental. 6 ed. Cengage Learning, Santa Fe, México